Exosomy wydzielane przez komórki redukują blizny

Pomimo faktu, że wyniki po zawale serca uległy poprawie w erze szybkiej reperfuzji, choroba niedokrwienna serca pozostaje wiodącą przyczyną zgonów na świecie.1,2 W celu odwrócenia uszkodzenia po MI, komórki pochodzące z kardiosphere (CDC) są obecnie w badaniach klinicznych fazy II z redukcją blizn jako głównym punktem końcowym. 3 Wykazano, że komórki pochodzące z kardiosfery zmniejszają masę blizn, zwiększają żywą masę i zatrzymują niekorzystne remodelowanie w wielu modelach zwierzęcych oraz w badaniu klinicznym fazy pierwszej.4-8 Kumulacja dowody wskazują, że w korzyściach CDC pośredniczy wydzielanie egzosomów.9,10 Te naturalne nanoskalowe pęcherzyki dwuwarstwowe lipidów pośredniczą w komunikacji komórkowej, 11,12 przynajmniej częściowo poprzez przeniesienie charakterystycznych ładunków mikroRNA (miRNA) i innych kodujące RNA13 specyficzne dla macierzystej komórki typu 14. Ekosomy z komórek pochodzących z kardiozyfery są niezbędne do podsumowania terapeutycznych korzyści CDC 9 jako część paradygmatu s wydaje się być możliwy do uogólnienia.11,15,16 Jedną potencjalną zaletą egzosomów nad CDC jest to, że są one bezkomórkowe i niereplikujące, co ułatwia rozwój stabilnego i niezawodnego produktu z półki.

Chociaż egzosomy mają oczywisty urok, nie zostały jeszcze przetestowane w klinicznie realistycznych modelach chorób zwierzęcych. Nawet podstawy dostawy pozostają niezbadane. Jako cząstki o rozmiarach nano egzosomy mogą nie nadawać się do dostarczania śródczaszkowego (IC), ponieważ mogą nie zostać łatwo pobrane podczas pierwszego przejścia. W związku z tym najpierw porównaliśmy dostarczanie exosomów IC i śródbłonkowej (IM) z exosomami CDC w modelu ostrego MI (w protokole zaprojektowanym do rekrutacji post-kondycjonowania komórkowego) .17,18 Następnie przeprowadziliśmy randomizowane badanie kontrolowane placebo, w którym ocenialiśmy dostarczanie IM pochodzących z CDC exosomów przy użyciu systemu mapowania elektrochemicznego NOGA® w świniowatym modelu MI z zawałem serca (w protokole zaprojektowanym do oceny regeneracji terapeutycznej).

Metody

Szczegółowe metody można znaleźć w materiałach uzupełniających online. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono na nieprzytomnych, znieczulonych świniach. Modele świni zawału mięśnia sercowego zostały szeroko zwalidowane jako wiarygodne modele do badań translacyjnych.19

Izolacja i charakterystyka exosomu komórek pochodzących z kardiosphere

Ludzkie CDC w piątym pasażu (od pojedynczego nie chorego dawcy ludzkiego) hodowano aż do konfluencji w regularnych pożywkach hodowlanych CDC1, który następnie zmieniono na pożywkę bez surowicy. Po 15 dniach zebrano kondycjonowaną pożywkę bez surowicy (zawierającą egzosomy) i przesączono przez filtr 450 nm. Następnie wydzielono egzosomy przez ultrafiltrację przez odwirowanie, a następnie strącenie przez noc w 25% glikolu polietylenowym (PEG); pożywkę zawierającą PEG odwirowano przez 30 minut przy 2000 x g, a osad zawierający egzosomy ponownie zawieszono w IMDM do iniekcji (w 10 ml w przypadku infuzji dootrzewnowej iw 2 ml w iniekcji doserowej). Stężenie białka zmierzono za pomocą testu Bradforda, a końcową zawiesinę analizowano za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA, NanoSight Ltd., Amesbury, Wiltshire, UK) w celu określenia liczby i wielkości cząstek.

Badanie ostre: dostawa

Protokół badania ostrego przedstawiono w materiałach uzupełniających online, rysunek S1A. MI z zamkniętymi klatkami piersiowymi zostały utworzone u 22 samic dorosłych świń Yucatan. Trzydzieści minut po reperfuzji zwierzęta przydzielono do otrzymywania egzosomów IC (15 mg [≈33 x 1011 cząstek] podawanych w infuzji przez 30 minut, n = 6), exosomów IM (15 mg podzielono na 10 iniekcji, n = 4, a następnie zmieniono na 7,5). mg [≈ 16,5 × 1011 cząstek], n = 5, ze względu na równoważną skuteczność, materiał dodatkowy online, rysunek S2B, a więc całkowita n = 9), lub pojazd IC jako kontrola (n = 7), a następnie przez 48 godzin. Dozowanie exosomu zostało ekstrapolowane z poprzedniej pracy u małych zwierząt. 10,20 rozmiaru zawału (IS), niedrożności mikronaczyniowej (MVO) i obszaru ryzyka (AAR) określono po 48 godzinach, jak opisano wcześniej.18 Mierzono funkcję lewej komory z zastosowaniem lewej komory przed zabiegiem i po 48 godzinach.

Ostre wynaczynienie i zatrzymanie egzosomów za pomocą różnych metod podawania zbadano, jak pokazano w materiałach uzupełniających online, rysunek S1B.

Randomizowane badanie przedkliniczne w modelu chronicznym

Projekt badania i dostawa exosome

Projekt badania jest przedstawiony w materiałach uzupełniających online, rysunek S1C. MI otworzono w klatce piersiowej u 13 dorosłych samic małych świnek Yucatan, jak opisano. 21 Cztery tygodnie później 12 zwierząt losowo przydzielono do grupy otrzymującej nośnik (IMDM, n = 6) lub iniekcję IM z exosomów pochodzących z CDC (7,5 mg stężenia białka [ ≈16,5 × 1011 cząsteczek], n = 6) za pomocą systemu nawigacji satelitarnej NOGA® (Biosense Webster, Inc., Diamond Bar, CA, USA). Zwierzęta następnie obserwowano przez dodatkowy miesiąc i poddano eutanazji. Rezonans magnetyczny przeprowadzono przed leczeniem (linia podstawowa) i po 1 miesiącu.

Aby potwierdzić nieskuteczność egzosomów IC, 4 dodatkowe świnie uległy zawałowi i były leczone egzosomami IC 4 tygodnie po MI .
[patrz też: buldog francuski olx, przychodnia dla dzieci warszawa, usg jamy brzusznej bydgoszcz ]